DNA-Sequencing ass och abhängig vu eiser Fäegkeet, Gelelektrophoresis ze benotzen, fir Strécke vu DNA ze trennen, déi mat der Gréisst vun esou wéineg wéi e Basispaar ënnerscheeden.
DNA Sequencing
An den 1970er Joren sinn zwee DNA-Sequenzéierstechniken fir méi DNA-Moleküle erfonnt ginn. Dëst waren d' Sänger (oder Dideoxy) -Methode an d' Maxam-Gilbert (chemesch Spatatioun). D'Maxam-Gilbert-Methode baséiert op der Nukleotid-spezifescher Spaltung vu Chemikalien an ass am beschten benotzt fir d'Sequenz vun Oligonucleotiden ze beweegen (kurze Nukleotidpolymeren, déi normalerweis méi wéi 50 Basenpaar laang sinn). D'Sanger-Method ass méi heefeg gebraucht ginn, well se technesch méi einfach an der Praxis befaasst ass, a mat der Viruerung vu PCR an der Automatisatioun vun der Technik ass ganz einfach fir langen Stréck vun der DNA applizéiert, dorënner eng ganz Genen. Dës Technik baséiert op Kënnenstermin vun Dideoxynucleotiden bei PCR-Dehnungsreaktiounen.
Sanger Method
An der Sanger-Methode gëtt d'DNA-Analyse benotzt als Schabloun benotzt an d'DNA-Polymerase ginn an enger PCR-Reaktioun benotzt fir komplementär Strécke mat Primer ze generéieren.
Véier verschiddene PCR Reaktionsmischungen ginn preparéiert, déi all e gewësse Prozentsaz vun Dideoxynucleosidtriphosphate (ddNTP) -Analogë mat engem vun de véier Nukleotiden (ATP, CTP, GTP oder TTP) hunn. D'Synthese vum neie DNA Strang setzt bis een vun dësen Analogie agebaut ass, a wéini dee Stroum viraus trunkelt ass.
All PCR-Reaktioun kënnt am Endeffekt mat enger Mëschung vu verschiddene Längt vun DNA Stréimen, alles endend mam Nukleotid, dee Dideoxy huet fir dës Reaktioun markéiert. D' Gelelektrophoresis gëtt dann benotzt fir d'Strécke vun de véier Reaktiounen op véier separate Bahnen ze trennen an d'Sequenz vun der ursprénglecher Schabloun ze bestëmmen, baséiert op wéi d'Längt vu Stränn mat deem Nukleotid kënnt.
An der automatiséierter Sanger Reaktioun ginn Primeren benotzt, déi mat véier verschiddene faarweg fluoreszstäteg Etiketten markéiert ginn. PCR-Reaktiounen, an d'Präsenz vun den ënnerschiddlechen Dideoxy-Nucleotiden, ginn wéi virdru beschriwwe gemaach. Déi nächst véier Reaktionsmischunge ginn dann kombinéiert an an eng eenzeg Spur vun engem Gel geluecht. D'Faarf vun all Fragment gëtt duerch en Laserstrahl festgestallt an d'Informatioun gëtt duerch e Computer erfaasst datt Chromatogramme fir all Faarwen ze weisen, vun deenen d'DNA-Sequenz vun der Schabloun ermittelt ginn ass.
Typesch ass de automatiséierter Sequenzéierungsmethod just ausgedeent fir Sequenzen bis maximal 700-800 Basenpaar. Allerdings ass et méiglech Vollennsequenzen vu méi grouss Genen ze kréien an tatsächlech ganz Genome, mat Schrëtt Methoden wéi Primer Walking a Shotgun Sequencing.
Am Primer Walking gëtt e funktionnéierten Deel vun engem gréissere Gén gefeet mat der Sanger-Methode. Nieft Primer ginn aus engem zouverlächlechen Segment vun der Sequenz agefouert an benotzt fir de Sequenzéierungsschnëtt ze verwierkenden an den Deel vum Gen, deen ausserhalb vun der ursprénglecher Reaktioun war.
Shotgun-Sequenzer entlaascht de randomiséierte DNA-Segment ze interesséieren an méi adäquat (handhaben) sgräumte Fragmenter, Sequencing all Fragment an d'Arrangatioun vun de Stécker op Basis vu iwwerlappende Sequenzen. Dës Technik ass méi einfach duerch d'Applikatioun vun Software fir d'Organisatioun vun den Iwwerlappungen ze maachen.