Wat PCR huet mat DNA-Sequencing an Verstäerkung vun Genen ze maachen
D'Polymerasekettenreaktioun ( PCR ) ass eng molekulare genetesch Technik fir méi Exemplare vun engem Gen ze maachen an ass och Deel vum Genequencingprozess.
Wéi funktionéiert d'Polymerase-Kettenreaktioun?
Gene Kopien ginn mat enger Probe vun der DNA gemaach an d'Technologie ass genuch duer fir verschidde Exemplare vun enger eenzeger Kopie vum Gengt ze maachen, deen an der Probe fonnt gouf. PCR-Verstäerkung vun engem Gen fir Millioune Kopië ze erméiglechen fir d'Detektioun an d'Identifikatioun vun Genssequenzen ze benotze visuell Techniken op Basis vu Gréisst a Frachnung (+ oder -) vum DNA Deel.
Ënner kontrolléierter Benotzung sinn kleng Segmenter vun der DNA duerch enzyme bekannt ginn als DNA-Polymerasen, déi komplementar Deoxynucleotiden (dNTPs) zu engem vun der "Schabloun" bekanntst Wierk addéieren. Och méi kleng Elementer vun DNA, déi "Primer" genannt gi sinn als Ausgangspunkt fir d'Polymerase. Primer sinn kleng mannegt Stécker vun DNA (Oligomeren), meeschtens tëschent 15 an 30 Nukleotiden laang. Si gi vu Wëssenschaft a kuerzen DNA-Sequenzen op déi ganz Enn vum Gens amplifizéiert. Bei der PCR gëtt d'DNA ze sequenzéiert ginn erhëtzt an déi doppelt Stréim trennen. Beim Ofkillen bidden d'Primer op d'Schabloun (genannt Annealing) an eng Plaz fir d'Polymerase ze bauen fir ze beginnen.
De PCR-Technique
D'Polymerasekettenreaktioun (PCR) gouf duerch d'Entdeckung vu thermophilem a thermophilem Polymerase-Enzyme (Enzyme, déi strukturell Integritéit an Funktionalitéit nom Erhale bei heigen Temperaturen erhalen).
D'Schrëtt déi an der PCR-Technik involvéiert sinn, sinn wéi folgend:
- Eng Mëschung gëtt mat optimiséierter Konzentratioun vun der DNA Schabloun, Polymerase-Enzym, Primer a DNTPs geschaffen. D'Kapazitéit fir d'Geméis ze verwierklechen ouni den den Enzym ze denaturéieren datt den Dämonelix vun der DNA Probe bei der Temperatur vun der 94 Grad Celsius denaturéiert gëtt.
- No Denaturairung gëtt d'Probe op enger méi moderéierter Band geknäppt, ronn 54 Grad, wat den Annexial (Bindung) vun de Primer zu den eenzelsträngegen DNA-Templates erleichtert.
- Am drëtt Stuf vum Zyklus gëtt d'Probe op 72 Grad erhéicht, déi ideal Temperatur fir Taq DNA Polymerase, fir d'Verlängerung. Während der Verlängerung benotzt d'DNA-Polymerase den ursprénglechen eenzegen Strang vun der DNA als Schabloun, fir komplementär dNTPs un d'3 'Enn vun all Primer ze addelen an eng Sectioun vun doppelstrangeg DNA an der Regioun vum Gen vun Interesse ze generéieren.
- Primer déi an DNA-Sequenzen gegléckelt hunn, déi net e genee Match sinn an 72 Grad net annexéiert, sou datt d'Verlängerung vum Gen ze limitéieren ass.
Dëse Prozess vun denaturéiert, annealing an der Verlängerung gëtt méi oft (30-40) mol erëmfonnt, an doduerch exponentiell d'Zuel vun den Exemplare vum gewënschten Gen am Mëschung vergréissert. Obwuel dëse Prozess esou laang onbedéngt wier, wann se manuell gemaach gi sinn, kënnen d'Proben an engem programmierbaren Thermocycler, deen heefegsten an de meeschte molekulare Laboren ubitt, an enger kompletter PCR-Reaktioun ka 3-4 Stonnen gemaach ginn.
All Denaturéierungsschrëtt hält den Verlängerungsprozess vum fréiere Zyklus ofgeschnidden an doduerch de neie Strang vun der DNA ofgeschnidden an hält se un ongeféier d'Gréisst vum gewünschten Gen.
D'Dauer vum Verlängerungszyklus kann méi laang oder kuerter ofhängeg vun der Gréisst vum Gens of Interesse gemaach ginn, awer schliisslech duerch wiederholte Zyklen vu PCR sinn d'Majoritéit vun Templates op d'Gréisst vum Gen vun der Interesse alleng beschränkt ginn, well se Wäerter aus Produkter vun deenen zwee Primer generéiert ginn.
Et ginn verschidden Faktore fir Erfolleg PCR , déi manipuléiert kënne ginn fir d'Resultater ze verbesseren. Déi am meeschte verbreet Methode fir d'Präsenz vum PCR-Produkt ze testen ass Agarosegelelektrophorese . Wat fir DNA-Fragmenter baséiert op der Gréisst an der Rechnung. D'Fragmenter sinn dann mat Faarf oder Radioisotopen visualiséiert.
Evolution
Zënter der Entdeckung vu PCR, sinn DNA-Polymerasen wéi déi ursprünglech Taq entdeckt ginn. E puer dovunner hunn eng besser "korrektread" Fäegkeet oder si méi stabil bei héijen Temperaturen, wouduerch d'Spezifitéit vu PCR verbessert an d'Ofleefung vu Feeler aus der Insertion vum falschen DNTP verbessert gëtt.
Verschidden Variatiounen vun der PCR sinn speziell fir spezifesch Applikatiounen konzipéiert a gi regelméisseg an molekulare genetesch Labore benotzt. E puer vun dësen sinn Real-Time PCR a Reverse-Transkriptase PCR. D'Entdeckung vu PCR huet och zur Entwécklung vu DNA-Sequencing, DNA-Fingerprinting an aner molekulare Techniken gefouert.