De Grad vun Proteinreinheet hängt vun der beabsichtigten Endverbrauch vum Protein.
Fir e puer Applikatiounen ass e roude Auszug genuch. Awer fir aner Utilisatiounen, wéi zB an Nahrungsmëttel a Pharmazeutik, gëtt et en héigen Niveau vu Räich. Fir dëst ze erreechen verschidden Methoden fir d'Proteinreinung typesch benotzt, an enger Rei vu Schrëtt vun der Schrëtt.
All Proteinreinigungsschrëtt änneren normalerweis e puer Grad Produktverloscht. Dofir ass eng ideale Proteinreinigungsstrategie eng, an där den héchsten Niveau vun der Purenatioun an de mannsten Schrëtt erreecht gëtt. D'Auswiel vun de Schrëtt fir ze benotzen ass ofhängeg vun der Gréisst, der Ladung, der Léisungsitéit an aneren Eegeschaften vum Zilprotein. Déi folgend Techniken sinn am meeschten passend fir d'Iwwerleeung vun engem eenzegen zytosolesche Protein. D'Purifikatioun vu cytosolesche Protein Komplexe ass méi komplizéiert an normalerweis erfuerderlech datt verschidde Methoden ugewandt ginn.
Éischt Schrëtt fir Proteinreinung
Den éischte Schrëtt bei der Reinigung vun intrazellulärer (innerhalb vun der Zelle) Proteinen ass d'Virbereedung vun engem Roude Auszug .
Den Extrait enthält eng komplexe Mëschung vun all de Proteinen aus dem Zell-Zytoplasma, a verschidde zousätzlech Makromolekelen, Kofaktoren a Nährstoffer. De Roude Auszug kann fir gewëssen Uwendungen an der Biotechnologie genotzt ginn, awer wann d'Richtegkeet e Problem ass, musse folgende Schrëtt ugebueden ginn.
Crude Protein-Ausschnëtter ginn duerch d'Entféierung vun Zellstécker produzéiert, déi duerch Zelle Lyse generéiert ginn, wat duerch Chemikalien a Enzyme , Sonikitéit oder eng Franséisch Press geliwwert gëtt. De Schouss gëtt duerch Zentrifugatioun geläscht a de Iwwerstand wäert erëmgeworf ginn. Zu kruter Präparatioune vun extrazellulären Proteinen kann erzielt ginn ginn andeems d'Zellen einfach duerch Zentrifugatioun eliminéiert ginn.
Fir verschidde Biotechnologie- Applikatiounen gëtt et eng Demande fir thermostabil Enzyme : Enzyme déi héicht Temperaturen ouni Denaturatioun toleréiere kënnen, a wa se eng ganz spezifesch Aktivitéit ënnerhalen. Organismen, déi se produzéieren, ginn heiansdo extremophiles genannt. Eng einfach Approche fir e wärendbeständesche Protein ze verdeelen ass déi aner Proteinen an der Miel ze verdeelen, duerno d'Léisung ze killen (sou datt de thermostabilen Enzym ze reforméieren oder z'ënnerschreiwen, wann et néideg ass. Denaturéiert Proteinen kënnen dann duerch Zentrifugatioun geläscht ginn.
Intermediate Purification Steps
An der Vergaangenheet ass e gemeinsame zweet Schrëtt fir d'Sécherheet vun engem Protein aus engem Roude Extract duerch Präziséierung an enger Léisung mat héiger osmotescher Kraaft (dh Salzléisungen). Nukleinsäuren am Roude Extrakt kënne entfernt ginn duerch d'Ausfällung vun Aggregaten, déi mat Streptomycin-Sulfat oder Protaminsulfat gebildet ginn.
Protein Ausfällung gëtt normalerweis gemaach mat Ammoniumsulfat als Salz.
Verschidde Proteinen wäerte sech an ënnerschiddleche Konzentratioune vum Ammoniumsulfat ausmécht . Allgemeng kréien Proteïen vu héiger Molekulargewicht an niddreg Konzentrierunge vu Ammoniumsulfat. D'Salzoffällung féiert net normalerweis zu engem héichgefälschten Protein, mee kann hëllefe bei der Beseitigung vu ongewollten Proteinen an enger Mëschung an d'Konzentratioun vun der Probe. Salze an der Léisung sinn dann duerch Dialyse duerch poröse Celluloseschlaangen, Filtratioun oder Gelausgrenzschromatographie ofgeschloss.
Modern Biotech-Protokollen profitéieren oft vun den villen kommerziell verfügbaren Kits, déi preparéiert Léisunge fir Standardprozeduren ubidden. D'Proteinreinung gëtt oft benotzt Filtern benotzt a gefilmt Gel Filtratiounskolonnen. Alles wat Dir maache musst, ass d'Instruktioune no a fügen den richtege Volumen vun der richtiger Léisung hinzuofen a waart d'spezifizéierter Längt vun der Zäit beim Sammelen de Eluant (wat aus dem aneren Enn vun der Kolonn ass) an engem frëschen Teströschen.
- Chromatographesch Methoden kënnen mat Bench-Top Späicher oder automateschen HPLC-Geräter applizéiert ginn. Trennung vu HPLC kann duerch Reversephasen, Ionenaustausch oder Ausmooss vu Methode gemaach ginn, an d'Proben déi duerch Diodenarray oder Lasertechnologie erkannt ginn.
Protein Visualiséierung an Assessment vun der Pensioun
- Reverse Phase Chromatographie (RPC) trennt Proteine op Basis vun hire relativen Hydrophobien . Dës Technik ass héich selektiv, awer erfuerderlech d'Benotzung vun organesche Léisungsmëttel. E puer Proteinen ginn dauerhaft vun Solvents denaturéiert an am Laf vum RPC verléieren si Funktionalitéit. Dofir ass dës Method net fir all Applikatioune recommandéiert, besonnesch wann et néideg ass fir de Zielprotein fir Aktivitéit ze halen.
- Ionenaustauschchromatographie bezitt sech op d'Ofscheidung vun Proteinen op Grond vun der Charge . Kolonnen kënnen entweder fir Anionenaustausch oder Kationenaustausch virbereet ginn. Anionenaustausch column enthält eng stationär Phase mat enger positiver Laascht, déi negativ beliwwert Proteinen anzeechent. Kationenaustausch Säulen sinn déi ëmgedréift, negativ opgeloossene Pearelen déi positiv beliwwert Proteine zoustëmmen. D'Elution vum Zilprotein (en) gëtt gemaach duerch Äntzens de pH-Wert an der Kolonn, wat zu enger Verännerung oder Neutraliséierung vun den geladenen funktionnele Gruppen vun all Proteinen resultéiert.
- Gréisst-Ausgrenzung Chromatographie ( Gelfiltration ) trennt méi grouss vu Proteinen vu klenge, well déi gréissere Moleküller méi séier duerch de vernetzte Polymer an der Chromatographie Spalt reesen. Déi grouss Proteëren passen net an d'Pore vum Polymer, an datt méi kleng Proteine maachen an méi laang ze duerchreegen duerch d'Chromatographie Spaltere, iwwert hir manner direkter Wee. Eluate gëtt an enger Serie vun Tubelen gesammelt, déi Proteine trennen, déi op Eluatiounszäit baséieren. Gel-Filtratioun ass e nëtzlechen Instrument fir d'Konzentrierung vun enger Proteinprobe ze ginn, well de Zilprotein an e klengt Eloutervolumen gesammelt ass wéi d'éischt an d'Kolonn geupackt gouf. Ähnlech Filtrationstechniken kënnen an enger grousser Proteinproduktioun benotzt ginn wéinst hirer Kosteleffizitéit.
- D'Affinitätschromatographie ass eng ganz nëtzlech Technik fir "Polieren" ze maachen oder den Proteinreinigungsprozess ofzemaachen. Beads an der Chromatographie Spalt sinn vernetzte Liganden, déi spezifesch dem Zielprotein binden. De Protein ass dann aus der Kolonn entfälscht ginn andeems d'Liwwerung mat enger Léisung enthalen. Dës Methode gitt déi purst Resultate an héchstens spezifesch Aktivitéit am Verglach zu aner Techniken.
- SDS-PAGE ass Polyacrylamidgelelektrophoresis, deen an der Präsenz vun SDS (Natriumdodecylsulfat) ausgeführt gëtt, deen an Proteinen bindet, déi hinnen eng grouss negativ Ladung niddereg ginn. Well d'Belaaschtunge vun all Proteinen zimlech gläich sinn, trennt dës Methode praktesch ganz op der Gréisst. SDS-PAGE ass oft benotzt fir d'Rengheet vum Protein no all Schrëtt an enger Serie ze testen. Wéi ongewollte Proteinen allgemeng aus der Mëschung ginn ausgetrennt sinn, reduzéiert d'Unzuel vun Bands, déi am SDS-PAGE-Gel visualiséiert ginn, bis datt et nëmmen eng Band ass, déi den gewünschte Protein representéiert.
- Immunoblotting ass eng Protein Visualiséierungstechnik, déi an Kombinatioun mat Affinitätschromatographie applizéiert gëtt. Antikörper fir e spezifescht Protein ginn als Liganden op enger Affinitätschromatographie Späicher benotzt. Den Zilprotein gëtt op der Kolonn zréckgezunn, duerno duerch Spuede vun der Kolonn mat enger Salzléisung oder aneren Asteroiden erfaasst. Antikörper verbonne mat radioaktiven oder Dye-Labels Hëllef bei der Detektioun vum Zilprotein, wann et vum Rest vun der Mëschung getrennt ass.
Quell:
Zubay G. 1988. Biochemie, 2.Dezember. Macmillan Publishing Co., New York, NY, USA.
Amersham Pharmacia Biotech. 1999. Protein Purification Handbook, Edition AB. Amersham Pharmacia Biotech Inc. New Jersey, USA. http://www.biochem.uiowa.edu/donelson/Database%20items/protein_purification_handbook.pdf.