Gene Cloning ass den Akt vu Kopien oder Klonen, vun engem eenzegen Gen. Wann e Gitt identifizéiert gëtt, kënnen Klonen op ville Beräicher vun der biomedizinescher a industrieller Fuerschung benotzt ginn. Genetesch Ingenieur ass de Prozess vu Klonen vun neie Genren an neie Organismen oder Ändern der DNA Sequenz fir de Proteinprodukt ze änneren. Genetesch Ingenieurs hänkt vun eiser Fäegkeet, déi folgend essentielle Prozeduren ze maachen.
01 Polymerase Chain Reaction
02 Restriktiv Enzyme
D'Entdeckung vu Enzyme bekannt als Restriktiouns Endkucleasen ass essentiell fir Protein Engineering . Dës Enzyme schneiden DNA op spezifesch Locale baséiert op der Nukleotidsequenz. Honnerte vu verschiddenen Restriktionsenzyme , déi DNA ze schneiden op engem ënnerscheet Site hunn, goufen aus vill verschiddene Bakterienstämme isoléiert. D'DNA duerchschnëtt mat engem Restriktionsenzym produzéiert vill kleng Fragmente vu variéiere Gréissten. Dës kënnen duerch Gelelektrophorese oder Chromatographie getrennt ginn.
03 Elektrophoresis
D'DNA aus enger Zellkultur ze schützen oder ze schrëftlechen Gebrauch vu Restriktionsenzyme wier net vill gebraucht ginn, wann mir d'DNA net visualiséieren - dat ass e Wee fir ze kucken, ob oder net Ären Extrait ass, oder wéi eng Gréisst Fragmenter hunn se ofgeschnidden. Ee Wee fir dat ze maachen ass duerch Gelelektrophorese. Gele gi fir eng Rei vun Zwecker benotzt, vu DNA ze gesinn fir DNA Inserts a Knockouts z'entdecken.
04 Kommt zwee Stückelen vun der DNA
An der genetescher Fuerschung ass et oft noutwendeg fir zwee oder méi individuell Stréimunge vun der DNA ze verbannen, e Rekombinantstrang ze kreéieren oder e richtege Strang ze schéissen deen mat Restriktionsenzyme geschnidden ass. Enzyme genannt DNA Liggen kënnen kovalente Bindungen tëschent Nukleotidketten erstellen. D'Enzyme DNA-Polymerase I an d'Polynucleotidkinase si wichteg och an dësem Prozess, fir d'Offalzung vun de Lénks oder d'Phosphorylierung vun den 5 'Enden respektéieren.
05 Selektioun vu Klengverspriechend DNA
Kleine kreesfërmeg Stéck DNA, déi net Deel vun engem bakteriellen Genom sinn, sinn awer fähig ze séier z'erreechen, sinn als Plasmid bekannt. Plasmiden ginn oft als Vektoren benotzt fir Genen tëscht Mikroorganismen ze transportéieren. An der Biotechnologie, wann de Gen of Interesse amplifizéiert ass an datt d'Gen an de Plasmid duerch Restriktionsenzyme geschnidden gi sinn, gi se verbonne mat der Erweiderung wat an enger Rekombinant DNA bekannt ass. Viral (Bakteriophage) D'DNA kann och als Véirung benotzt ginn, wéi et Cosmiden, rekombinante Plasmiden, déi Bakteriophage-Genen enthalen.
06 Method fir e Vector zu engem Host Cell ze verschécken
De Prozess vun de geneteschen Materialen op engem Vektor wéi Plasmid, an nei Wirtzellen, gëtt Transformation genannt. Dës Technik erfuerdert datt d'Wirtzellen op eng ëmweltbezunn Ännerung exponéiert ginn, déi se "kompetent" oder zeitweileg permeabel fir de Vektor ubelaangt. D'Elektroporatioun ass ee vun dësen Techniken. Wat méi grouss ass de Plasmid, wat d'Effizienz méi wéi d'Zelle gëtt. Gréissere DNA-Segmenter si méi einfach mat Bakteriophagen, Retroviren oder anere virale Vektoren oder Cosmiden an enger Methode déi Transdektioun genannt gëtt. Phage oder virale Vektoren ginn oft an der Regenerative Medizin benotzt, mä kann d'Insertion vun der DNA an de Bestandde vun eise Chromosomen erofhuelen, wou mir et net wëllt, datt et Komplikatiounen a souguer Kriibs verursaacht.
07 Methoden fir Transgenen Organismen auswielen
Net all Zelle ginn DNA bei der Transformatioun. Et ass essentiell datt et eng Method fir d'Detektioun vun deem ze maachen. Generell kënnen Plasmide Genen fir Antibiotikwiderstoffer a transgene Zellen kënnen op Basis vun der Expression vun deene Genen ausgewielt ginn an hir Fähigkeit ze wuessen op Medien déi dës Antibiotikum enthalen. Alternativ Auswielungsmethoden hänken vun der Präsenz vun anere Reporterproteine wéi den x-gal / lacZ- System oder e grénge Fluoreszenzprotein, wat Selektioun baséiert op der Faarf a vun der Fluoreszenz erméiglecht.