Anpassungen un ee vun de Komponenten vun enger Polymerase Chain Reaction (PCR) Reaktioun kënnen d'Qualitéit vum Resultat geännert ginn, entweder duerch d'Verbesserung oder Diminutioun vum Produkt Rendement oder Qualitéit oder duerch d'Verbesserung der Reaktionsspezifitéit an d'Sensibilitéit. Parameteren, déi d'Enn vum Resultat beaflossen, kënnt entweder physesch (dh Temperatur, Zykluszeiten) oder chemesch (dh Schablounskonzentration, Typ vum Enzym benotzt). Déi folgend sinn e puer Faktoren, déi den Erfolleg vun der PCR beaflosst.
01 Clean Laboratory Conditions
Well PCR kann an engem eenzelen Molekül vun der DNA feststellen, ass et wichteg fir onrealistesch Konditiounen am Labo ze pflegen. Frësch Handschuucht stoussen, benotzen d'sterile Glasware, Tubakproduiten an Pipettepräisser a sterile Léisungen, a réit d'Aarbechtsgebitt vir d'Aarbecht ze botzen.
Iwwerhaapt beinhalt d'Kontrollreaktiounen, ouni Schablonen DNA an ouni Enzym, fir datt d'Resultater si wierklech wéinst der Verstäerkung vun der richtiger Probe sécher sinn.
Déi meescht Leit suergen dofir datt hir eegene Léisunge gëtt, déi net gedeelt ginn, fir d'Problembehandlung ze maachen, méi liicht a bestëmmte Pipetten oft fir PCR ofgeschloss ginn. DNase- a RNase-freie PCR-Tubaks, aerosol-beständeg Pipettenspitzen an an enger Fume Kappe mat UV Liicht sinn och Weeër fir Problemer ze minimiséieren.
02 Chemesch Komponenten
- Huelt 18 bis 24 Basen
- Huet keng sekundär Struktur (dh Faarwen)
- Gitt bal equilibréiert Verdeelung vun G / C an A / T Paar
- Sinn net komplementär zuenee bei den 3-Fouss Enquete
- Hëlt Temperaturen (Tm) ongeféier 5-10 Grad Celcius ënnert der Glühtemperatur, déi normalerweis tëscht 55 an 65 Grad Celcius
De Tm fir béid Primer sollt och fir d'beschte Resultater sinn.
03 Reaktioun Mix: Schabloun an Primer
Optimale Primerkonzentraktioune sinn tëscht 0,1 a 0,6 μmol / L. De Betrag vun der Schabloun variéiert jee no der Type vun der DNA (mënschlech, bakteriell, Plasmid).
Mat ganz vill Mounts vu Schabloun, et ginn aner Strategien fir d'Resultater ze verbesseren, wéi zousätzlech Zuelenummeren oder d'Benotzung vum "Hot Start". Always testen nei Primeren mat enger positiver Kontrollreaktioun, fir sécher ze sinn, datt se ënnert Äre spezifeschen experimentellen Konditiounen erfëllen.
04 Reaktioun Mix: Enzym Aktivitéit
D'Konzentraktioun vu MgCl2 am Reaktiounsmix kann d'Resultat vum PCR beaflossen an eng grouss Roll spillen an méi séier Reakteren. Magnesium Kation bildet lueslle Komplexe mat dNTPs fir de eigentleche Substrat ze produzéieren deen d'Polymerase-Enzym erkennt.
Gläich Mounts vun alle véier DNTPs hëllefen och d'Polymerasefehlergeschwindegkeet ze reduzéieren. Bestëmmten Additive wéi Betain, BSA, Detergentin, DMSO, Glycerol a Pyrophosphatase kënnen och d'Enzymspezifesch oder d'Reaktiounseffizienz beaflossen.
05 Typ Thermocycler
Wann Dir Akafszentren am Laboratoaraustrëtt denkt, dréit Dir vir, datt verschidden Thermocyclere manner präzis wéi anerer sinn, fir exakt Wënschstemperaturen ze erhaalen.
Dëst ass ee Gebitt wou bëlleg hinkt net op laang Si bezuele wann Dir mat enger kuscheleg Reaktioun konfrontéiert oder Primer benotzt gëtt, déi e schmuele Spektrum vun Glühtemperatur brauchen.
Dünnwandt Reaktiounsréieren entwéckelt fir d'präzis Marke vum Thermocycler ze benotzen, déi Dir benotzt, hëllefen och d'Reaktiounstemperaturen ze optimiséieren.
06 Cycle Settings
Zousätzlech Rendement kann erreecht ginn duerch d'Erhéijung vun der Verlängerungszäit ëm all 20 Zyklen, fir manner Enzym ze kompenséieren fir méi Templett ze vergréisseren. Normalerweis si manner wéi 40 Zyklen genuch fir 10 mol Moleküle ze vergréisseren an eng Konzentratioun déi grouss genuch ass fir op engem Ethidiumbromidfenger Agarosegel ze gesinn .